注射用胸腺肽α1主要成分為胸腺肽α1，是化學(xué)合成的28肽，臨床用于慢性乙型肝炎和作為免疫損害病者的疫苗免疫應(yīng)答增強(qiáng)劑。在2010年版中國藥典二部中收錄的注射用胸腺肽α1標(biāo)準(zhǔn)［1］和國家食品藥品監(jiān)督管理局頒布的藥品試行標(biāo)準(zhǔn)（YBH26822005）中規(guī)定的含量測定方法，梯度洗脫時(shí)間較長，操作繁瑣且重復(fù)性較差。本實(shí)驗(yàn)對(duì)注射用胸腺肽α1含量測定方法進(jìn)行了改進(jìn)，現(xiàn)報(bào)道如下。

    1 試藥與儀器

    1.1 試藥

    胸腺肽α1對(duì)照品及注射用胸腺肽α1（海南某藥品研發(fā)公司提供），對(duì)照品含量：99.78%，乙腈為色譜純，磷酸二氫鉀為分析純。

    1.2 儀器

    Agilent 1100 高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；DAD二極管陣列檢測器（美國安捷倫公司）。

    2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

    2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

    色譜柱：Luna C18 ( 5μm ，4.6mm×250mm)；以0.05mol/L磷酸二氫鉀緩沖液(pH5.7)�惨译�(92∶8)為流動(dòng)相A，乙腈為流動(dòng)相B，采用梯度洗脫，在8min之內(nèi)流動(dòng)相B由3%增加到9%，在2min之內(nèi)流動(dòng)相B降為3%，并平衡5min，檢測波長為210nm，進(jìn)樣量20μL，理論板數(shù)按胸腺肽α1峰計(jì)算應(yīng)大于5000。

    2.2 測定方法

    余邦良等.HPLC法測定注射用胸腺肽α1的含量
    取本品適量，用0.05mol/L磷酸二氫鉀緩沖液(pH6.8)溶解，制成1mL中約含胸腺肽α1 0.1mg的溶液，作為供試品溶液（臨用前配制），精密量取20μL，注入液相色譜儀，參照高效液相色譜法［2］，記錄色譜圖；另精密稱取胸腺肽α1對(duì)照品適量，用0.05mol/L磷酸二氫鉀緩沖液(pH6.8)溶解，制成1mL中約含胸腺肽α1 0.1mg的溶液，作為對(duì)照品溶液（臨用前配制），同法測定，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，其平均含量應(yīng)符合規(guī)定。

    2.3 輔料干擾試驗(yàn)

    按處方量精密稱取甘露醇、氫氧化鈉，并另取注射用胸腺肽α1，按“2.2項(xiàng)”制成輔料溶液和供試品溶液，分別取20μL注入液相色譜儀，按含量測定法記錄色譜圖（圖1、2），從圖譜上可以看出, 這些輔料在主峰吸收處均無吸收，故不影響注射用胸腺肽α1含量的測定。

    2.4 回收率試驗(yàn)

    稱取按處方量計(jì)算的輔料9份，分別加入標(biāo)示量80%、100%、120%的胸腺肽α1，每種標(biāo)示量各3份樣，分別置相應(yīng)的量瓶中，按“2.2項(xiàng)”制成供試品溶液，按含量測定方法，記錄色譜圖，計(jì)算其回收率。平均回收率為99.4%，RSD為0.25%。

    2.5 精密度試驗(yàn)

    取同一批號(hào)的注射用胸腺肽α1 6瓶，按“2.2項(xiàng)”制成供試品溶液，按含量測定方法，每個(gè)供試品溶液平行測定6次，記錄色譜圖，主峰面積的RSD為0.34%。

    2.6 配液穩(wěn)定性試驗(yàn)

    取注射用胸腺肽α1適量，按“2.2項(xiàng)”制成供試品溶液，將其放置在20～25℃的室溫下，分別于配樣后第0、2、4、8、12h取樣按含量測定方法分析，主峰面積的RSD為0.54%，結(jié)果表明供試品溶液在12h內(nèi)較穩(wěn)定。

    2.7 線性試驗(yàn)

    取注射用胸腺肽α1適量，按“2.2項(xiàng)”制成1mL中約含胸腺肽α1 1mg的溶液，并分別稀釋成含胸腺肽α1 0.8、0.4、0.2、0.1、0.05 mg/L 的溶液，按含量測定方法測定，記錄色譜圖，以進(jìn)樣濃度X（mg/L ）為橫坐標(biāo)，胸腺肽α1峰面積積分值Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。計(jì)算其線性方程為：Y=18980X+13480433，r=0.9999。線性范圍0.05～0.8mg/L。

    2.8 樣品含量測定

    取注射用胸腺肽α1 8瓶（1.6mg/瓶），各瓶精密加入0.05mol/L磷酸二氫鉀緩沖液(pH6.8)1.6mL溶解，合并，精密吸取5mL置50mL量瓶中，稀釋至刻度，制成1mL中約含胸腺肽α1 0.1mg的溶液，作為供試品溶液（臨用前配制），精密量取20μL，注入液相色譜儀，按高效液相色譜法［2］，記錄色譜圖；另取經(jīng)五氧化二磷干燥至恒重的胸腺肽α1對(duì)照品適量，同法測定，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算其平均含量。3批樣品含量分別為100.9%、100.1%、100.2%。

    3 討論

    原法 “YBH26822005” 的含量測定的梯度洗脫，在20min內(nèi)流動(dòng)相B由0增加到9%，然后在1min內(nèi)流動(dòng)相B降為0，并用流動(dòng)相A平衡10min。經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該法耗時(shí)長，且重現(xiàn)性差。本文對(duì)其梯度洗脫法進(jìn)行修改：在8min之內(nèi)流動(dòng)相B由3%增加到9%，在2min之內(nèi)流動(dòng)相B降為3%，并平衡5min。

    通過方法學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)各項(xiàng)試驗(yàn)均符合規(guī)定，且與原法的含量檢測結(jié)果一致，同時(shí)克服原法檢測時(shí)間長、重現(xiàn)性差的缺點(diǎn)。使用該法測定含量準(zhǔn)確、快速、簡便，專屬性提高，有利于更好地控制產(chǎn)品質(zhì)量，進(jìn)一步完善產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

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