近年來的研究表明帕金森病(PD)的發病具有遺傳學基礎，隨著家族性PD致病基因的相繼定位與克隆，分子遺傳學在PD發病機制中的作用越來越受到關注。家族性PD雖少見，卻為研究PD的遺傳因素提供了極好的機會和條件，為探索PD的發病原因及新的治療方法提供思路。PARK1(α�瞫ynuclein)是首先被發現的與遺傳性PD有關的基因，已有兩個點突變G88C和G209A被確認。目前關于PARK1基因突變在我國大的PD家系中的研究報道較少，尤其是在北方的家系研究中未見，本文對搜集到的一個北方PD常染色體顯性遺傳大家系進行研究，篩查是否存在PARK1的G88C及G209A錯義突變。

　　1 資料與方法

　　1.1 家系資料 該家系祖籍為吉林省白山市，漢族，可追溯4代25人，其中9例發病(3人已去世)，4人可疑，呈常染色體顯性遺傳模式。見圖1。PD臨床診斷依據2006年中華醫學會神經病學分會運動障礙及帕金森病學組制定的PD診斷標準。該家系發病成員起病年齡為20～40歲，具有典型PD癥狀，均以震顫及強直起病，伴有不同程度的PD非運動癥狀，無明顯智能減退，口服左旋多巴治療有效，癥狀逐年加重。先證者女性，1951年出生，于1997年于吉林大學第二醫院神經內科確診為PD。查體(服息寧控釋片50/200半片后1 h)：血壓110/70 mmHg，面部表情僵硬，雙腕部張力呈齒輪樣增高，雙上肢肌張力輕度鉛管樣增高，雙下肢肌力鉛管樣增高，以右側肢體為重。走路協同動作減少，前驅前傾體姿。病理反射陰性。常規生化檢查未見異常，頭部MRI未見異常。共搜集6名已發病患者的臨床及血液樣本資料，并搜集家系成員12例血液樣本。

　　圖1 帕金森病一家系圖譜

　　1.2 方法

　　1.2.1 DNA提取 所有家系成員均取肘靜脈血8 ml枸櫞酸鈉抗凝，采用TaKaRa全血基因組DNA提取試劑盒提取白細胞基因組DNA。

　　1.2.2 聚合酶鏈反應(PCR) PARK1 3、4號外顯子PCR引物序列均參照Polymeropoulous文章〔1，2〕。引物均由上海sagon公司合成，反應體系含：50 ng/μl gDNA 2.0 μl，100 μmol/L dNTP 2.0 μl，50 ng/μl引物各1.0 μl，10×PCR緩沖液(含MgCl2)5 μl，Taq酶0.2 μl，加ddH2O至50 μl，10×PCR緩沖液和Taq酶均由TaKaRa公司生產。PCR反應條件：94℃ 5 min;94℃ 30 s，外顯子3 49℃(外顯子4 55℃) 30 s，72℃ 40 s，共30個循環;72℃ 延伸6 min。以1%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠(EB)染色，在紫外燈下觀察結果，并用TaKaRa PCR產物純化試劑盒對產物進行純化，利于酶切反應。表1 擴增PARK1 3、4號外顯子片段所用引物序列。

　　1.2.3 限制性片段長度多態性分析(PCR�睷FLP) PCR純化產物各取20 μl，分別用限制性內切酶MvaI(外顯子3)及NmucI(外顯子4)在37℃恒溫下酶切4 h(兩種限制性內切酶產地為MBI)，產物以1%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，凝膠成像系統下觀察結果并攝像。若存在G88C突變，外顯子3產物可被MvaI酶切為136和56 bp兩個片段;若存在G209A突變，外顯子4產物可被NmucI酶切為128和88 bp兩個片段。

　　2 結 果

　　18名家系成員(包括已發病的成員)的DNA模版，經PCR

　　擴增后均獲得了192 bp及216 bp的產物，所有產物分別經過MvaI(外顯子3)及NmucI(外顯子4)酶切后均未獲得切開片段。

　　3 討 論

　　迄今為止，PD的藥物治療還只是對癥治療，并不能延緩疾病的進展，研究家族性PD患者基因突變很有可能為從分子水平闡明PD發病的潛在機制起作用，同時也能從預防和延緩疾病進展方面，為探索PD新的治療方法提供思路。對PD家系的致病相關基因進行研究將有助于PD的臨床診斷、遺傳咨詢，并可能對該病的治療和預防有重要意義，并有可能發現新的基因突變類型或新的致病基因，故研究家族性PD的致病基因有重要的意義。PD的遺傳學病因一直是神經病學研究的熱點話題。近年來，關于基因方面的研究進展很快，已經發現13個染色體位點以孟德爾遺傳方式與PD連鎖，其中呈常染色體顯性遺傳的有8個，常染色體隱性遺傳的4個，有一個尚未完全明確遺傳方式〔3〕。常染色體顯性遺傳性PD的臨床特點概括來說包括起病年齡早(平均年齡在50歲以下)，癡呆發生率高，病程短，對多巴胺治療反應良好。病理學改變為Lewy體PD。

　　1996年Polymeropoulos等〔1〕對一個意大利呈常染色體顯性遺傳(AD)的PD家系進行基因組掃描和連鎖分析后，將致病基因定位于4q21��23，并于1997年克隆了該致病基因α�瞫ynuclein基因，確定其致病原因為PARK1基因在第4號外顯子上的1個錯義點突變G209A所致，使其編碼的53位氨基酸由丙氨酸(Ala)置換為蘇氨酸(Thr)。1998年在一德國常染色體顯性遺傳PD家系中發現了該基因的另一個點突變位點，位于3號外顯子的G88C突變，導致第30位的丙氨酸(Ala)被脯氨酸(Pro)置換〔4〕。自該基因被定位，之后許多科學家在家族性PD中篩查這兩個突變位點，只是在部分希臘家系中獲得陽性結果，其他地域的研究絕大多數為陰性結果。目前家系研究顯示，該基因可能僅構成少量以發病年齡早、外顯率高、常染色體顯性遺傳為特征的家族性PD的致病基因。該基因的突變是罕見的，在PD患者中占不到1%〔5〕。本研究中該常染色體顯性遺傳大家系中也未見此突變。

　　下一步將在該家系中繼續進行其他常見基因突變位點的篩選，并繼續進行本地PD家系的收集，為進行遺傳連鎖分析打下基礎。通過研究目前已發現的家族性PD家系的致病基因，也為今后更多的家族性PD的研究提供新思路。

【參考文獻】
　　1 Polymeropoulos MH,Higgins JJ,Golbe LI,et al.Mapping of a gene for Parkinson′s disease to chromosome 4q21�瞦23〔J〕.Science,1996;274(5290)：1197��8.
　　2 Polymeropoulos MH,Christian L,Elisabeth L,et al.Mutation in the α�睸ynuclein gene identified in families with Parkinson′s disease〔J〕.Science,1997;276(5321):2045��7.
　　3 Serena R,Nir G,Avi OU.Advances in the genetics of Parkinson′s disease〔J〕.Acta Pharmacol Sin，2008;29(1):21��34.
　　4 Kruger R,Kuhn W,Muller T,et al.Ala30pro mutation in the gene encoding alpha�瞫yn in Parkinson′s disease〔J〕.Nat Genet,1998;18(2):106��8.
　　5 Maraganore DM,de Andrade M,Elbaz A,et al.Collaborative analysis of alpha�瞫ynuclein gene promoter variability and Parkinson disease〔J〕. JAMA，2006;296(8):661��70.

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